医学前沿：外泌体 - 知乎
医学前沿：外泌体 - 知乎切换模式写文章登录/注册医学前沿：外泌体启领生物外泌体（exosome）是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。☑ 1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。☑ 1987年，Johnstone将其命名为“Exosome”。☑ 1996年，G.Raposo发现类似于B淋巴细胞能分泌抗原提呈外泌体，这种外泌体携带MHC-Ⅱ类分子、共刺激因子和粘附因子。☑ 1998年，L.Zitvogel等发现树突细胞（DC cell）也能产生有抗原提呈能力的外泌体，而且外泌体含有功能性的MHC-I类II类分子，还有共刺激因子。☑ 2007年，H.Valadi等发现，细胞之间可以通过外泌体中的RNA来交换遗传物质。这意味着细胞可以通过外泌体影响另外一个细胞，甚至可以把自己的基因强加给另外一个细胞。☑ 2013年，细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制获“诺贝尔生理或医学奖”，使外泌体的研究达到全新的高度。☑ 2015年，JHuan等人证实了急性髓细胞白血病（AML）的外泌体在白血病的骨髓微环境中具有抑制造血干细胞的功能。同年，诱导多能干(iPS)细胞的外泌体可以在心肌细胞受到急性心肌缺血（MIR）影响时，给心肌细胞传送保护信号。☑ 2016年-至今，外泌体研究广泛分布在干细胞、免疫、microRNA、靶向给药、癌症的诊断及治疗等都是热门研究领域。最早外泌体被认为是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白，但近数年研究中发现，外泌体所携带的的“货物”具有重要的生物学意义。一般而言，外泌体都会含有以下几种物质：MHC I类和/或II类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白、mRNA 和其他非编码 RNA以及各种代谢酶。▲外泌体组成外泌体的具体形成机制目前仍不清楚，但现有研究认为，不同类型的细胞形成外泌体的过程可能大同小异。细胞通过内吞作用产生小囊泡，小囊泡融合形成早期核内体（early endosome），并逐渐变为晚期核内体（late endosome）。随着胞质内miRNA、酶分子、热休克蛋白等一些“货物”的进入，晚期核内体会产生很多小囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），并逐渐演变成多泡体（multivesicular body，MVB）；随后，这些小囊泡会被释放到胞外，形成外泌体。▲外泌体形成和分泌过程在被细胞释放后，外泌体会进入体液，随着循环系统到达其他细胞或组织内。在外泌体表明会有很多特殊标志物，以区别来源。不同来源的外泌体会通过内吞作用进入受体细胞，这个过程有三种不同机制：①外泌体进入受体细胞后，将“货物”释放进入胞质内，并重新形成多泡体。②外泌体将“货物”释放进入胞质，但自身与细胞质膜融合。③外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊受体结合，既能起到信号传导作用，也能通过内吞作用，将“货物”运入胞内。根据其生物合成或释放途径可以对细胞外囊泡进行分类：①外泌体(exosomes)：起源于内吞途径，直径为30-150nm，其密度约为1.11-1.19g mL-1。②微粒/微囊泡（microparticles）:直接从质膜释放，直径约100-1000nm。③凋亡小体（apoptoticbody/bleb）:由细胞凋亡产生，直径约为50nm-2um。④肿瘤小泡（large oncosomes）:由肿瘤细胞释放产生，直径约1-10um。⑤其他各种EV亚群。目前常用的外泌体的提取方法主要包括：差速离心法、超滤法、试剂法。▲外泌体不同分离方法汇总1、差速离心差速离心是外泌体分离的最常见技术之一，常用于细胞培养上清中外泌体。步骤如下所述。注意：所有离心分离应在 4 ℃ 下进行。同时吸取上清时小心操作，避免吸入细胞或者细胞碎片。①低速离心以除去细胞成分，300g离心10min。收集上清。②低速离心去除死细胞，2000g离心10min。收集上清。③高速离心以消除细胞碎片，10000g离心70min。收集上清。④高速离心以沉淀外泌体。100000g离心70min。收集沉淀。⑤外泌体重悬于适量PBS中，消除污染蛋白质， 100000g离心70min。收集沉淀。⑥分装外泌体悬液，-80℃保存，避免反复冻融。▲差速离心法示意图2、超滤法超滤法适用于细胞上清的提取，一般需要 200ml 培养基，适用于纯化大量外泌体。最常见的过滤膜有孔径 0.8 微米， 0.45 微米或 0.22 微米，可用于收集大于 800 纳米， 400 纳米或 200 纳米的外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性。①低速离心以除去细胞成分， 500g 离心 10min 。收集上清。②使用 0.22 微米过滤器过滤细胞碎片以及大囊泡。收集滤液。③将滤液转移至装有超滤膜的超滤仪，氮气加压过滤。收集滤液。④将过滤后悬液转移至离心管，100000g离心40min。收集沉淀。⑤外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤 , 分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。▲超滤法示意图3、试剂盒法试剂盒法适用于细胞上清，一般需要 50-100ml 培养基。该试剂盒使用容易和快速，耗时短。①低速离心以除去细胞成分，3000g离心10min。收集上清。②将滤液转移至离心管，加入试剂。③上下颠倒混匀。④1500g离心30min，管底可见沉淀，小心弃去上清。⑤1500g离心10min，小心弃去上清。⑥外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤 , 分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。▲外泌体提取试剂盒外泌体堪称一位 “亦正亦邪”的“多面手”，疾病的发生发展离不开它，免疫作用离不开它，疫苗也可以用到它，疾病诊断有时也需要它，并且更多外泌体做的“坏事”和“好事”还在被不断发现，更多外泌体的作用也在不断被发掘。 现在我们来看一看到目前为止，Clinicaltrials中登记的临床试验，了解下外泌体在临床中的应用进展。截止目前，登记在册的临床研究，含已完成、招募中、未招募、终止招募等在内的临床研究共计有57项。▶ 在已完成临床试验的研究中，外泌体应用领域有：癌症及子痫早期诊断、帕金森病、血小板功能及凝血、肿瘤疫苗。▲已完成临床试验的研究▶ 正在招募的临床试验中，外泌体应用领域有：癌症的早期诊断、肿瘤预后监测、免疫治疗、多囊卵巢综合症疾病诊断、组织修复等。▲正在招募中的临床试验研究从临床的研究来看，外泌体在诊断、治疗等方面有广泛的应用，用涉及领域包括内分泌疾病、癌症等多个方面。尽管对于外泌体发生机制、生物学功能等还有很多的未解之谜，但相信随着外泌体研究工作的深入开展及研究手段的不断更新，外泌体的表达调控机理将 会进一步被揭示。随着精准医疗概念的提出，越来越多的研究者开始关注如何做到疾病的精准诊断和治疗。外泌体作为一个新型的研究热点，由于它在体内分布的广泛性和获取的便捷性，已经成为疾病诊断治疗的潜在有效方式，在精准医疗上有着光明的前景。未来我们不仅可以通过外泌体中信号分子进行疾病诊断、个性化预测，还可以用于疫苗开发与免疫治疗、基因治疗、靶向药物治疗等，这也为心脑血管疾病、癌症等医学难题的最终攻克带来新的曙光。参考文献：[1] Chen Bo-Yie., Sung Cheyenne Wei-Hsuan., Chen Chihchen., Cheng Chao-Min., Lin David Pei-Cheng., Huang Chin-Te., Hsu Min-Yen., (2019). Advances in exosomes technology., Clin. Chim. Acta, 493, 14-19.[2] Yamashita Takuma., Takahashi Yuki., Takakura Yoshinobu., (2018). Possibility of Exosome-Based Therapeutics and Challenges in Production of Exosomes Eligible for Therapeutic Application., Biol. Pharm. Bull., 41, 835-842.[3] He Chuanjiang., Zheng Shu., Luo Yan., Wang Ben., (2018). Exosome Theranostics: Biology and Translational Medicine., Theranostics, 8, 237-255.[4] Zhang Lin., Yu Dihua., (2019). Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity., Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 1871, 455-468.[5] 吴金恩，丁军涛. 外泌体生物学功能及应用研究进展(2016). 动物医学进展，37(12):90-94.[6] https://www.clinicaltrials.gov/-exocomehttps://mp.weixin.qq.com/s/1YA3sHXU07l16PagFAocgg发布于 2020-06-30 09:32赞同 713 条评论分享喜欢收藏申请
外泌体（Exosomes）全解析 - 知乎
外泌体（Exosomes）全解析 - 知乎首发于百奥动物切换模式写文章登录/注册外泌体（Exosomes）全解析百奥赛图已认证账号自“细胞囊泡运输的调节机制在2013年获得诺贝尔生理或医学奖后，外泌体（Exosomes）逐步成为全球生物医学领域研究的热门话题！所有细胞，原核生物和真核生物，均会释放胞外囊泡Extracellular Vesicles (EVs)。EVs大致可分为ectosomes和exosomes两类外泌体。ectosomes是通过向外出芽夹在质膜表面的囊泡，包括微囊泡、微粒和直径约为50 nm～1 mm的大囊泡。exosomes是直径范围约为40至160 nm（平均约100 nm）的EV，具有内泌体来源。外泌体，可以包含细胞的许多成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物以及胞质和细胞表面蛋白。细胞生成外泌体的生理目的推测是外泌体可能从细胞中清除过量和/或不必要的成分，以维持细胞内稳态。外泌体与免疫反应、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中枢神经系统相关疾病和癌症进展有关。外泌体递送到受体细胞的蛋白质、代谢产物和核酸有效地改变了它们的生物学反应。这种外泌体介导的反应可能是疾病促进或抑制。外泌体在调节复杂的细胞内通路中的内在特性推进了其在许多疾病的治疗控制中的潜在效用，包括神经退行性疾病和癌症。外泌体可以被改造成递送不同的治疗有效负荷，包括短干扰RNA、反义寡核苷酸、化疗药物和免疫球蛋白。外泌体的脂质和蛋白质组成可影响其药代动力学特性，其天然成分可能在增强生物利用度和最小化不良反应中发挥作用。外泌体除了具有治疗潜力外，还具有帮助疾病诊断的潜力。它们在所有的生物体液中都有报道，通过生物体液的采样（液体活检）很容易获得外泌体复杂物质的组成。基于外泌体的液体活检突出了其在诊断和确定癌症和其他疾病患者预后方面的潜在效用。疾病进展和治疗反应也可以通过外泌体的多组分分析来确定。图1. 外泌体功能和特征[1]外泌体的生物合成外泌体的产生过程涉及质膜的双重内陷和含有腔内囊泡intraluminal vesicles (ILVs)的细胞内多泡体multivesicular bodies (MVBs)的形成。ILV最终通过质膜的损伤和MVB胞吐作用以直径范围约为40-160 nm的外泌体形式分泌（图2）。1).质膜的第一次内陷形成杯状结构，包括细胞表面蛋白和与细胞外环境相关的可溶性蛋白（图2）。2).这导致了早期分选内体early-sorting endosome (ESE)的新生形成，在某些情况下可能直接与预先存在的ESE合并[1]。图2.细胞外囊泡和外泌体的同一性和异质性[1] ESEs可以成熟为晚期分选内体late-sorting endosomes (LSEs)，最终生成MVBs，也称为多囊泡内体。MVBs由胞内体界膜向内内陷（即质膜双重内陷）形成。这一过程导致MVB含有几种ILV（未来的外泌体）。MVB既可以与溶酶体或自噬体融合降解，也可以与质膜融合释放所含的ILV作为外泌体。根据外泌体数据库的最新更新列表[2]，包含9769个蛋白质、3408个mRNA、2838个miRNA和1116个脂质。外泌体的这些内容物可作为癌症进展的预后标志物和（或）分级依据。同时调节肿瘤生长、转移、血管生成，介导肿瘤细胞耐药（图3）。图3.外泌体的生物合成及其内容[1]外泌体的异质性外泌体的异质性包括：大小异质性、含量异质性、功能异质性和细胞来源异质性（图2）。 尺寸不等可能是由于MVB界膜内陷不均匀，导致液体和固体的总含量不同，外泌体可能包含由不同大小范围定义的亚群。大小异质性也会导致不同量的外泌体含量；微环境和细胞固有的生物学可能影响外泌体的含量及其生物学标志物。外泌体可含有膜蛋白、胞质和核蛋白、细胞外基质蛋白、代谢产物和核酸，即mRNA、非编码RNA种类和DNA；外泌体对受体细胞的影响可以不同，因为它们的细胞表面受体表达各不相同，这样的功能性有不同的表现，1. 诱导细胞存活，2. 诱导细胞凋亡，3. 诱导免疫调节等（图2）；异质性也可以基于外泌体的起源器官和组织，包括它们是否来自癌细胞，使它们具有独特的特性，如对某些器官的趋向性和特定细胞类型的摄取。所有这些特征的组合将有可能引起更高阶的复杂性和外泌体的异质性。外泌体与肿瘤免疫外泌体DNA在免疫反应中的作用也被证明与癌症进展相关。外泌体引起的适应性免疫应答包括树突状细胞活化伴乳腺癌细胞来源的外泌体基因组DNA摄取、cGAS-STING信号活化和小鼠抗肿瘤应答。在体外，T细胞接触后，树突状细胞的启动（改变树突状细胞活性以增强其对未来刺激反应的免疫指令）也与T细胞外泌体基因组和线粒体DNA (mtDNA)的摄取有关，通过cGAS-STING信号诱导I型IFN的产生。在癌症背景下，这种外泌体DNA脱落可能是有益的，这样抑制癌细胞中的EGFR导致这些细胞外泌体中的DNA增加，并且可以诱导树突状细胞中的cGAS-STING信号，有助于整体抑制肿瘤生长。相比之下，肿瘤外泌体DNA对炎症反应的影响可间接恶化癌症，循环中性粒细胞摄取肿瘤源性外泌体DNA可增强组织因子和IL-8的产生，后者在促进肿瘤炎症和副肿瘤事件（血栓形成）中发挥作用。外泌体也可能通过影响受体细胞中的基因表达和信号通路来调节免疫反应，主要是通过miRNA的转移。外泌体miRNA可以在树突状细胞之间交换并抑制基因表达，这种外泌体介导的细胞间通讯可能影响树突状细胞成熟。肿瘤来源的外泌体如miR-212-3p会下调树突状细胞中的MHC-II转录因子RFXAP（调节因子X相关蛋白），可能促进癌细胞的免疫逃避。肿瘤来源的外泌体mir222-3p会下调单核细胞中的SOCS3（细胞因子信号传导抑制因子3），从而促进STAT3介导的M2极化的巨噬细胞，可能产生免疫抑制微环境。外泌体对免疫应答的调节也可能涉及免疫调节分子的呈递，如PD-L1（程序性细胞死亡配体1）和FasL（Fas细胞表面死亡受体配体）。黑色素瘤来源的外泌体上的PD-L1在体内抑制CD8 + T细胞抗肿瘤功能，癌细胞来源的外泌体以PD-L1依赖的方式阻断树突状细胞成熟和迁移。此外，癌细胞来源的PD-L1 + 外泌体促进荷瘤小鼠引流淋巴结中T细胞耗竭，促进肿瘤生长。黑色素瘤或前列腺癌来源的外泌体上的FasL诱导Fas依赖性T细胞凋亡。除外泌体外，配体介导的T细胞信号传导和与表达CD39（三磷酸外切核苷二磷酸水解酶1）和CD73 (5′nuleotidase)的多种人类癌细胞类型来源的外泌体相关的酶活性导致T细胞中5′AMP转化为腺苷和腺苷信号传导，在体外有效限制其活化。这些作用最终可能抑制适应性免疫应答。相比之下，肥大细胞来源的外泌体在体外和体内表达MHC-Ⅱ、CD86、LFA-1（淋巴细胞功能相关抗原1）和ICAM-1（细胞间粘附分子1），诱导B细胞和T细胞的增殖。最后，癌细胞来源的外泌体被改造为过表达CD40L（CD40配体或CD154，T细胞上的共刺激分子，与APC上的CD40结合），促进树突状细胞成熟，导致体内T细胞增殖和抗肿瘤活性增加。外泌体在癌症先天性免疫反应中的作用也有报道。来自胰腺癌细胞和胰腺癌患者血浆的外泌体通过作为诱饵限制补体介导的裂解，从而降低对癌细胞的细胞毒性。外泌体HSP72（热休克蛋白70 kDa蛋白1）可通过STAT3触发髓源性抑制细胞活化，胶质母细胞瘤干细胞来源的外泌体诱导STAT3介导的巨噬细胞表型免疫抑制（M2型）转换，这将限制肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应。来自癌细胞的外泌体miR-21和miR-29a触发巨噬细胞中人TLR8和小鼠TLR7介导的NF-kB（核因子-kB）活化以及IL-6和TNF-a的产生促进小鼠黑色素瘤肺转移和肺癌。（图4）图4.肿瘤微环境中外泌体的信号转导途径[4]神经退行性疾病外泌体生物发生和神经元细胞中分泌囊泡调节之间的交集为外泌体与神经退行性疾病发病机制之间的假定联系提供了新的认识。外泌体可能促进或限制未折叠和异常折叠蛋白在大脑中的聚集。外泌体可以参与对错误折叠蛋白的清除，从而发挥解毒和神经保护功能，或参与错误折叠蛋白的繁殖和聚集，有效促进蛋白聚集体的“传染性”，有助于疾病进展。外泌体的这种相反功能可能并不相互排斥，现介绍如下。使用GW4869（抑制MVB向内出芽）进行药理学阻断或使用莫能菌素（增加细胞内Ca2 + 和MVB生成）增强外泌体生成，分别导致感染性朊蛋白PrPsc的传递减少或增加，这与体外Creutzfeldt–Jakob病相关。Tau和Ab（淀粉样前体蛋白[APP]裂解产生的b-淀粉样蛋白）均与阿尔茨海默病有关，存在于外泌体中，包括患者脑脊液来源的外泌体(Tau)、小鼠小胶质细胞培养上清来源的外泌体(Tau)、以及小鼠和人细胞系(Ab)培养物上清液的外泌体。在体外和体内观察到外泌体对Tau聚集的病理性传播。外泌体生物发生机制也可能具有神经保护作用。外泌体可能损害神经毒性低聚物的形成或外泌体可能将其携带出细胞。最近，工程化过表达APP的小鼠大脑外泌体分泌Ab与毒性淀粉样蛋白的启动和繁殖有关。这一过程涉及ECE1/2（内皮素转换酶1/2）的失调，有效地导致APP转基因小鼠大脑外泌体中寡聚化Ab的增加。在不同的蛋白病（proteinopathies）如帕金森病(PD)和肌萎缩侧索硬化(ALS)中也观察到了类似的结果。尽管外泌体在神经退行性疾病中的功能集中在外泌体控制错误折叠的蛋白质积累，核酸和其他成分可能与恶化或改善其他神经系统疾病有关。在一项评估孤独症谱系障碍(ASD)儿童血清来源的外泌体的研究中，mtDNA外泌体物质不正确地分泌小胶质细胞IL-1b，可能诱发ASD相关的炎症。外泌体在神经退行性疾病和ASD病理生理学中的作用需要更多的研究，但这并没有阻碍将其用于治疗开发的努力。这种努力在很大程度上受到外泌体有效通过血脑屏障的内在特性的鼓励，血脑屏障是一种血管网络，作为选择性过滤器，防止药物或毒素到达大脑。外泌体的临床应用外泌体在疾病中的生物学中的作用不断被发现，同时阐述其在各种病理诊断和治疗中的效用的研究数量也大幅增加。这利用了外泌体分泌的复杂物质，允许疾病检测和监测的多组分诊断窗口。外泌体在将功能性货物递送到病变细胞中的特性也有利于其作为治疗载体，无论是在基础水平还是应用水平。诊断检测外泌体在所有生物体液中都有发现，并由所有细胞分泌，使其作为微创液体活检具有吸引力，有可能纵向采样跟踪疾病进展。外泌体生物发生能够捕获复杂的细胞外和细胞内分子货物，用于全面的、多参数的诊断检测（图3）。外泌体上的表面蛋白也有利于其免疫捕获和富集。一直以来，外泌体诊断应用重点的疾病包括CVDs、影响中枢神经系统(CNS)的疾病和癌症。这种努力正在迅速扩展到涉及肝脏、肾脏和肺的其他疾病。研究认为，在外泌体中可以发现少量的DNA，这种DNA可以对检测血清外泌体中癌症相关突变有价值，外泌体中特定的miRNA或miRNA组可能在癌症的检测中提供诊断或预后潜力。外泌体中的致癌和抑癌miRNA可能具有较高的诊断价值，因为它们在癌细胞和正常细胞之间的差异表达，可能增强它们在早期诊断中的有用性，致癌Kras被报道在外泌体中差异富集miR-100，循环中外泌体miR-21升高与胶质母细胞瘤和胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌和食管癌相关，尿源性外泌体miR-21升高与膀胱癌和前列腺癌相关。其他与多种癌症类型相关的外泌体致癌microRNA包括miR-155、miR-17-92簇和miR-1246。在脑、胰腺、结直肠、结肠、肝脏、乳腺、前列腺和食管癌；口腔鳞状细胞癌；以及淋巴瘤和白血病中观察到上调。肿瘤抑制miRNA，包括miR-146a和miR-34a，与肝脏、乳腺、结肠、胰腺和血液恶性肿瘤相关。疾病治疗外泌体作为药物或作为药物递送载体的治疗潜力正在被积极的探索（图3）。与脂质体相比，注射的外泌体可有效进入其他细胞，并可在小鼠外源性给药后以最小的免疫清除递送功能性分子。此外，外泌体的治疗应用前景广阔，因为它们已被证实耐受性良好。来源于间充质细胞及上皮细胞的外泌体在小鼠中重复注射时不会诱导毒性。MSC来源的外泌体已被提出是治疗本身，使用MSC来源的外泌体治疗移植物抗宿主病患者表明，重复注射耐受性良好，没有实质性副作用，未引起患者反应。基于其表面配体呈递富集，外泌体也可能使受体介导的组织靶向的发展成为可能。工程化外泌体上的配体富集也可用于诱导或抑制受体细胞中的信号事件或将外泌体靶向特定的细胞类型。例如，整合素特异性RGD（R，精氨酸；G，甘氨酸；D，天冬氨酸）修饰的肽（修饰的肿瘤归巢肽序列，作为整合素的识别序列）对未成熟树突状细胞来源的外泌体负载多柔比星，在乳腺荷瘤小鼠中显示治疗反应。其他化疗化合物也被装载到外泌体中进行癌症治疗，并在小鼠中进行了测试，并报道了抗肿瘤疗效和降低毒性。例如，巨噬细胞来源的外泌体负载紫杉醇诱导小鼠肺肿瘤反应[3]。（图5）图5.以外泌体为载体，精确靶向治疗肿瘤[3]基于外泌体microRNA有效地参与靶mRNA并抑制受体细胞中基因表达的观察结果，外泌体工程递送特定的miRNA或小干扰RNA(siRNA)有效负荷已被开发用于CNS疾病和癌症。外泌体RNA可能受到血源性核糖核酸酶的保护而不被降解，与脂质体相比，结合优越的全身滞留，可以使外泌体在远处发挥其功能。使用外泌体递送miRNA或siRNA有效负荷的临床前试验集中于对啮齿类动物的乳腺癌、胶质瘤和胰腺癌治疗，以及探索性脑靶向。使用GE11合成肽修饰的外泌体靶向EGFR + 乳腺癌细胞，并将microRNA let-7a递送至癌细胞，限制了其在体内的生长。MSC来源的外泌体能够在大鼠胶质瘤中传递miR-146b和靶向EGFR。临床级的MSC来源的外泌体与KrasG12D siRNA有效载荷(Exosomes)已被用于治疗多种动物模型中的胰腺癌。这些研究表明，Exosomes作为单一药物给药，小鼠的总生存期大幅增加，并能够实现特异性靶标结合，而没有任何明显的毒性。研究表明，外泌体上的CD47导致“不要吃我”信号，保护它们免受吞噬作用，限制它们从循环中清除。此外，与癌细胞相关的巨胞饮增强了外源性给予的Exosomes的进入。总之，这些早期临床数据和大量的临床前研究为开发外泌体作为治疗药物提供了鼓励。商业资讯：一系列大型制药公司的交易表明，该行业正在拥抱外泌体，包括外泌体药物、外泌体诊断以及外泌体药物递送等。外泌体可将核酸药物递送至难以到达的组织，从而达到治疗肿瘤及阿斯海默症等神经退行性疾病等目的。2020年仅在6月，礼来、武田和拜耳就宣布了外泌体公司相关的超过10亿美元的交易（表1）[4]。此外，近年来，一些新兴公司如雨后春笋般涌现，如Aegle Therapeutics、Anjarium Biosciences、Capricor Therapeutics、Creative Medical Technology Holdings、Everkine Corporation、Exogenus Therapeutics、Kimera Labs、Codiak BioSciences、Evox Therapeutics、Exosome Diagnostics、HansaBioMed、NonosomiX 等不少公司正在开发胞外体检测工具、治疗方法或药物载体等产品。胞外体诊断平台除了应用于癌症领域之外，还可望应用于免疫学、心血管疾病、传染病和中枢神经系统疾病在内的许多临床领域，未来有更多以胞外体为主的疾病诊断诊断技术或标靶治疗产品诞生。参考资料：1. The biology, function, and biomedical applications of exosomes, Kalluri et al., Science 367, 640 (2020)2. http://www.exocarta.org3.Jie Dai, et al.Exosomes: key players in cancer and potential therapeutic strategy，Signal Transduction and Targeted Therap.2020 Aug 5; 5(1): 145. 4. Big pharma buys into exosomes for drug delivery，Nature Biotechnology，2020百奥动物立足全球生物医药行业，从技术创新出发，百奥赛图建立“BioMice百奥动物”子品牌。百奥动物集创新动物模型研发制备、生产供应和实验服务为一体，拥有2500余个独特基因编辑动物/细胞系模型，覆盖肿瘤，自免，代谢等多个疾病领域，包括重度免疫缺陷B-NDG及系列小鼠、靶点人源化小鼠和全人抗体RenMice三大系列产品，结合优质的药理药效评价服务，以高标准的3大动物中心为支撑，极大的满足了全球科学研究和药物开发需求。创新的动物模型、高标准的质量管理、多元化的服务平台，助推生物医药创新产业的快速发展。发布于 2022-06-02 09:26外泌体癌症免疫疗法生物医药赞同 493 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录百奥动物百奥赛图建立“BioMice百奥动物”子品牌。生物百科什么是外
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外泌体顶刊综述 | Science：外泌体的生物学、功能和生物医学应用 - 知乎
外泌体顶刊综述 | Science：外泌体的生物学、功能和生物医学应用 - 知乎首发于科研热点/套路/进展切换模式写文章登录/注册外泌体顶刊综述 | Science：外泌体的生物学、功能和生物医学应用尐尐呅液体活检三大标志物之一的外泌体（exosomes），近几年研究热度持续攀升。2020年初，外泌体领域的顶级专家Raghu Kalluri和Valerie S. LeBleu在Science发表综述，详细总结了外泌体的生物发生、异质性、功能以及在生物医学中的应用。 外泌体：在人体中具有多种功能的细胞到细胞的运输系统外泌体是所有细胞产生的胞外小泡，携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物。它们是健康和疾病中细胞间近距离通讯的介质，影响细胞生物学的各个方面。 外泌体的生物学发生及异质性外泌体的生物发生 细胞质膜内陷，将一些细胞外成分和细胞膜蛋白包裹在一起，形成早期内涵体（ESEs），这些ESEs可以与其他细胞器发生物质交换，或者不同ESEs之间融合形成晚期内涵体（LSEs），进一步形成细胞内多膜体（MVBs），其中会包含许多腔内囊泡（ILVs），这些ILVs将来就可能会被释放成为外泌体。细胞形成MVBs后可能会通过与自噬体或溶酶体融合而被降解，也可能通过与质膜融合，释放其中的物质，包括ILVs，这些ILVs就是最终形成的外泌体。 细胞外囊泡（EVs）通常分为两大类：ectosomes和exosomes。ectosomes通过质膜出芽释放，大小在50 ~ 1mm之间。相比之下，exosomes是内体来源的，直径范围约为40至160 nm（平均约为100 nm）。外泌体是一个高度异质性的群体，具有独特的诱导复杂生物学反应的能力。外泌体的异质性可以根据其大小、含量(载物)、对受体细胞的功能影响以及细胞来源来概念化。这些特征的不同组合导致了外泌体的复杂异质性。外泌体的功能外泌体可能作为细胞之间物质和信号通讯的途径，不同的细胞通过分泌携带不同组分的外泌体实现细胞间通讯，这些外泌体被受体细胞吸收，通过物质交换或释放内含物实现物质和信号的交流。例如，KRAS突变表达诱导的致癌信号通过大胞饮作用促进人胰腺癌细胞外泌体摄取。人类的生殖，妊娠和胚胎发育需要精细/动态的细胞间通信。精液、羊水、血液和母乳都含有具有假定功能的外泌体。精浆外泌体与精子成熟有关。分子谱显示，microRNAs let-7a, let-7b, miR-148a, miR-375和 miR-99a富集于来自多个人类捐赠者的精浆来源外泌体中，这些miRNA与白细胞介素(IL-10和IL-13)的表达有关，提高了外泌体在生殖道常驻免疫中发挥作用的可能性。精浆来源的外泌体也能抑制HIV-1感染，可能是通过阻断HIV早期蛋白转录激活剂(Tat)的招募和HIV-1的后续转录。外泌体在免疫反应中的作用已被广泛记录。但应注意的是，在小鼠中，长时间内重复使用相对低剂量的小鼠或人类细胞源性外泌体时，未观察到严重的免疫反应。尽管如此，最近的工程外泌体实验表明，外泌体在诱导适应性和先天免疫反应方面具有一定的功能，这支持了它们在治疗发展方面的效用，以及在协调对感染性病原体或癌症的免疫反应方面的潜在作用。此外，外泌体与疾病的研究表明：1. 外泌体可能在代谢性疾病的出现以及心血管健康中发挥作用。2. 外泌体生物发生和神经元细胞中分泌小泡的调节之间的交集为外泌体和神经退行性疾病的发病机制之间假定的联系提供了新的见解。3. 与研究外泌体在其他疾病中的作用相比，外泌体在癌症中的研究进展迅速，而且外泌体与癌症的几个主要特征有关。外泌体影响肿瘤、肿瘤生长和转移、副肿瘤综合征和治疗耐药性。外泌体在癌症进展中的作用可能是动态的，并且与癌症的类型、遗传学和分期有关。外泌体的临床应用1. 在疾病诊断中的应用潜能：外泌体存在于所有的生物体液中，并由所有细胞分泌，这使得外泌体在液体活检中具有吸引力，可用于纵向取样跟踪疾病进展。外泌体的生物发生可以捕获复杂的细胞外和细胞内分子，可用于全面的、多参数的诊断检测。外泌体的表面蛋白也有助于其免疫捕获和富集。外泌体诊断应用的重点疾病包括心血管病、影响中枢神经系统的疾病和癌症。这项努力正在迅速扩展到肝脏、肾脏和肺部的其他疾病。2. 在疾病治疗中的应用潜能：外泌体向病变细胞运送功能物质的特性有利于它们作为治疗载体。与脂质体相比，外泌体的免疫清除率低。此外外泌体已被证实且具有良好的耐受性，无明显副作用。外泌体的研究是一个活跃的研究领域，正在进行的技术和实验进展可能会产生关于它们的异质性和生物学功能的有价值的信息，并增强利用它们的治疗和诊断潜力的能力。是否外泌体的产生和内容物随年龄变化？这些信息可以为组织衰老、器官退化和程序化或过早老化提供新的见解。EVs和/或外泌体是否先于地球上单细胞有机体首次出现？这是一个大胆而诱人的猜测。单外泌体的鉴定和分离以及低温电子显微镜分析有可能大大提高我们对外泌体基础生物学的理解以及它们在应用科学和技术中的应用。参考文献Kalluri R, LeBleu V S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes[J]. Science, 2020, 367(6478).图片来源：均来源于参考文献，如有侵权请联系删除。发布于 2021-03-09 10:11外泌体生物医学赞同 1194 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录科研热点/套路
最近听说细胞外泌体很火，到底什么是细胞外泌体？ - 知乎
最近听说细胞外泌体很火，到底什么是细胞外泌体？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册细胞免疫最近听说细胞外泌体很火，到底什么是细胞外泌体？所谓冻干的和液态的有啥不一样显示全部 关注者14被浏览27,315关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享10 个回答默认排序MedChemExpress已认证账号 关注MedChemExpress.cn荣获 2013 年诺贝尔奖的外泌体，至今仍为国自然的研究热点，十年来热度只增不减 (2022 年依然能稳居国自然热点排行第 5 名)！外泌体凭啥能成为科研宠儿？一起来看看吧~1. 外泌体：从“细胞垃圾”到诺奖新星外泌体最先于 1983 年被 R M Johnstone 等人在体外培养的绵羊网织红细胞上清液中发现[1] 。然而，当时学术界认为外泌体只是红细胞的 “代谢废物”。因此，在很长一段时间里，外泌体始终都是一个籍籍无名的 “细胞垃圾”。直至 2013 年，James E. Rothman、Randy W. Schekman 以及 Thomas C. Südhof 三位科学家发现细胞囊泡 (外泌体等) 运输调控机制，荣获诺贝尔生理/医学奖，让世界重新认识到外泌体这个自由穿梭于细胞间的运货小能手~小 M 也为大家整理过外泌体的实验研究套路，可参考往期推文：外泌体，顶刊新宠丨一文 get 研究套路！言归正传！外泌体 (Exosome) 是一种由细胞分泌到细胞外的囊泡 (图 1)，直径为 40-150 nm，几乎能从所有细胞 (无论是原核细胞还是真核细胞) 中释放，广泛存在于各种生物体液 (血液、尿液、精液、唾液、母乳、脑脊液以及胆汁等) 中。图 1. 外泌体的结构及功能[2]。外泌体装载着各种细胞成分 (包括蛋白质、脂类、核酸、糖类、细胞器等)，频繁穿梭于细胞间，将货物分子运送到正确目的地，实现细胞间信号传递。并且，外泌体大小不一，成分各异，能发挥不同的生物活性。初次接触外泌体的小伙伴们是不是很难捋清外泌体与各种囊泡的关系？是否被各种五花八门的囊泡缩写搞得头疼？为方便各位更好进食本文，小 M 整理出一份外泌体相关囊泡的区分清单 (表 1)，请保存使用哦~ 表 1. 外泌体相关囊泡区分表[2][3][4][5]2. 外泌体：如何产生？目前，主流观点认为外泌体的产生过程为：细胞膜内陷形成内体，内体通过二次内陷形成细胞内多泡体 (MVBs)，最后 MVBs 与细胞质膜融合，以胞吐的方式将 MVBs 的腔内囊泡 (ILVs) 分泌到细胞外，成为外泌体 (图 2)。2.1 外泌体的生物发生1) ESE 与 LSE 形成细胞外成分，如蛋白质、脂类、代谢物、小分子和离子 (图 2)，可通过内吞和质膜内陷与细胞表面蛋白质一起进入细胞，并在细胞腔侧出芽形成早期分选内体 (ESE)，或使萌芽与由内质网、反式高尔基体网络 (TGN) 和线粒体等成分形成的 ESE 融合 (ESE 也可与 ER 和 TGN 融合)。ESE 又可进一步形成晚期分选内体 (LSE)。2) ILVs 与 MVBs 形成LSE 充盈着各种内含物 (蛋白质、核酸、脂类等)，所以，当 LSE 膜内陷时，混合、随机地包裹内含物，形成多个腔内囊泡 (ILVs)。也就是说，根据内陷量，该过程会产生具有不同内含物和不同大小的 ILVs。LSE 膜内陷剩余的膜作为外膜，使形成的 ILVs 集中在 LSE 腔内，也即，LSE 进一步形成了细胞内多泡体 (MVBs)。简单来说，ILVs 是在 MVBs 中形成的。3) 外泌体形成MVBs 可与自噬体融合，最终其内容物可在溶酶体中降解 (MVBs 也可以直接与溶酶体融合进行降解)，降解产物可被细胞回收利用。此外，MVBs 也可通过细胞骨架和微管网络运输到质膜，并在 MVBs 对接蛋白的帮助下与质膜融合，通过胞吐作用，将 MVBs 的 ILVs 分泌到细胞外成为外泌体。图 2. 外泌体的内含物和生物发生[2]。2.2 外泌体具有异质性前面说到，LSE 通过膜内陷产生内含物各异的 ILVs，ILVs 被 MVBs 分泌到细胞外从而成为外泌体。然而，MVBs 外膜内陷不均匀，会使外泌体内含物不一致。并且，MVBs 也可与其他 ILVs 和细胞器融合，从而导致外泌体成分的多样性。此外，根据来源细胞的不同，外泌体的内含物也会产生差异。简单来说，外泌体具有异质性。图 3. 外泌体异质性[2]。外泌体的异质性可根据其大小、内容物、对受体细胞的功能性影响以及来源细胞来进行概念化 (图 3)。这些特征的不同组合所形成的外泌体在生物体内会展示出不同的生物活性。3. 外泌体：凭啥成为科研宠儿？目前，外泌体在疾病诊断、治疗以及药物递送三个方面，都展现出较好的研究潜力 (图 4)。图 4. 外泌体的三个主要研究方向[6]。 3.1 外泌体：疾病诊断标志物外泌体是细胞 (包括癌细胞) 释放到周围生物流体中的小囊泡。这些外泌体含有源自肿瘤的物质，如 DNA、RNA、蛋白质、脂质、糖结构和代谢物。因此，在病理微环境下产生的外泌体能够捕获特定疾病阶段或损伤所特有的复杂细胞内分子特征，是一个极具潜力的生物标志物库。重要的是，从血液或其他生物流体中分离出的肿瘤中过度表达的蛋白质并不一定具有癌症特异性。非癌症组织也能产生相同的标志物，并在正常人体内产生不同数量的标志物。而通过用组织特异性 (或癌症特异性) 标志物富集外泌体，可以获得更高的灵敏度和/或特异性。外泌体作为疾病诊断标志物的优势：1) 广泛存在于各种生物流体中，并非常稳定;2) 可在疾病早期阶段进行诊断 (外泌体在肿瘤形成的各个阶段从细胞中主动释放出来);3) 可实现癌症特异性标志物的富集 (图 5);4) (液体活检相较于组织活检) 创伤小、成本低、可实时了解肿瘤状态;5) 相较于组织活检，可减少患者取样痛苦;6) 易储存：冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥。相较于传统的组织活检，基于外泌体的液体活检具有更高的应用价值。目前，首个基于外泌体 RNA 的前列腺癌检测方法也已问世[7]。图 5. 外泌体可实现癌症特异性标志物的富集[8]。3.2 外泌体：良好的疾病治疗潜力从多种细胞中提取的外泌体可通过各种途径与靶细胞相互作用，包括内吞、直接结合、吞噬和直接融合，从而产生特定的治疗效果。比如，Jeongyeon Heo 等人研究发现，外泌体在不同细胞类型 (包括内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞) 之间进行物质交换可改善动脉粥样硬化[9]。此外，外泌体在癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病以及免疫与炎症等疾病中也具有生物活性。3.3 外泌体：天然的药物递送载体外泌体可被修饰以靶向特定细胞，能负载多种类的药物，并具有优越的穿透各种组织屏障的能力 (比如血脑屏障)，是优良的天然药物递送载体。相较而言，外泌体表现出比脂质纳米颗粒 (LNP) 更低的免疫原性，毒性也显著降低 (表 2)。外泌体也表现出更好的药物封装、控释以及体内生物分布能力。此外，外泌体在肿瘤细胞内的粘附性和内化性比同等大小的脂质体高 10 倍，这说明，外泌体对癌症的靶向性更高。 表 2. 外泌体与脂质纳米颗粒的药物递送能力对比[2][6][10]。 外泌体作为药物递送载体的潜力已被大量研究证实。Menghui Zhang 等人的临床前研究显示，工程外泌体能够高效、精确地将抗肿瘤药物递送到小鼠肿瘤部位，并减少了与治疗相关的不良反应 (图 6)[11]。图 6. 临床前模型中显示抗肿瘤效果的工程外泌体示意图[11]。如图 6 所示，静脉注射后，携带药物分子的工程外泌体在多种靶向分子的引导下到达肿瘤部位。然后，化疗药物 (如 PTX)、ncRNA (如 miR-551-3p)、免疫分子 (如 siPDL1) 被释放到肿瘤微环境 (TME) 中。最终，工程外泌体的内化导致肿瘤细胞死亡。4. 小结本期推文为大家详细介绍了外泌体的特点、生物发生过程以及三大研究方向：疾病的诊断、治疗以及药物递送。外泌体研究领域极其广泛，在癌症、免疫反应、心血管疾病、中枢神经系统疾病等领域都有深入的研究。掌握外泌体的研究方法，会让我们发现外泌体的更多可能！外泌体化合物库收录了 40+ 种具有激活或抑制外泌体分泌的化合物，是外泌体研究的有用工具。 GW4869竞争性的中性鞘磷脂酶 (N-SMase) 抑制剂，IC50 值为 1 μM；是外泌体合成/释放的抑制剂。Lansoprazole质子泵抑制剂，能抑制胃酸生成；是中性鞘磷脂酶 (N-SMase) 的抑制剂 (外泌体抑制剂)。Exosome Isolation and Purification Kit (from cell culture media)细胞上清外泌体提取纯化试剂盒。MOG (35-55) (TFA)Exosome Isolation and Purification Kit (from plasma and serum)Tipifarnib (IND 58359) 抑制法尼基转移酶 (FTase)，IC50 为 0.86 nM。Tipifarnib 具有潜在抗肿瘤和抗寄生虫活性。Tipifarnib法尼基转移酶 (FTase) 抑制剂，IC50 为 0.86 nM；具有潜在抗肿瘤活性；是外泌体 (exosome) 生成和/或分泌的有效抑制剂。U-104有效的碳酸酐酶 (CA) 抑制剂；有效的外泌体 (exosome) 抑制剂，IC50 为 0.2 μM。MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务参考文献：[1] Pan BT, et al. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: selective externalization of the receptor. Cell. 1983 Jul;33(3):967-78.[2] Kalluri R, et al. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020 Feb 7;367(6478):eaau6977.[3] EL Andaloussi S, et al Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57.[4] Cocozza F, et al. SnapShot: Extracellular Vesicles. Cell. 2020 Jul 9;182(1):262-262.e1.[5] Chen B, et al. Endocytic sorting and recycling require membrane phosphatidylserine asymmetry maintained by TAT-1/CHAT-1. PLoS Genet. 2010 Dec 9;6(12):e1001235.[6] Escudé Martinez de Castilla P, et al. Extracellular vesicles as a drug delivery system: A systematic review of preclinical studies. Adv Drug Deliv Rev. 2021 Aug;175:113801.[7] Li Y, et al. A Novel Urine Exosomal lncRNA Assay to Improve the Detection of Prostate Cancer at Initial Biopsy: A Retrospective Multicenter Diagnostic Feasibility Study. Cancers (Basel). 2021 Aug 13;13(16):4075.[8] Yu W, et al. Exosome-based liquid biopsies in cancer: opportunities and challenges. Ann Oncol. 2021 Apr;32(4):466-477.[9] Heo J, et al. Exosome-Based Treatment for Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2022 Jan 17;23(2):1002.[10] Shimon MB, et al. The Big Potential of Small Particles: Lipid-Based Nanoparticles and Exosomes in Vaccination. Vaccines (Basel). 2022 Jul 13;10(7):1119.[11] Zhang M, et al. Engineered exosomes from different sources for cancer-targeted therapy. Signal Transduct Target Ther. 2023 Mar 15;8(1):124.发布于 2023-11-12 16:07赞同 4添加评论分享收藏喜欢收起学神007执业药师资格证持证人 关注参考答案：1.概念：外泌体是一类有细胞释放的细胞外囊泡，包含了mRNA，micro RNA等，蛋白质的小膜泡，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。2.背景：1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987Johnstone将其命名为“exosome”。各种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。3.研究意义：调节宿主-病原体的相互作用，参与传染性和炎性疾、神经疾病和癌症等很多种疾病的病理过程，同时在正常的生理过程中也发挥着介导细胞间通讯的重要功能，在发育中也发挥着重要作用。含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力。4.冷冻干燥水有三相，O点为三相共点，OA为冰的融解点。根据压力减小、沸点下降的原理，只要压力在三相点压力之下，物料中的水分则可从水不经过液相而直接升华为水汽。根据这个原理，就可以先将食品的湿原料冻结至冰点之下，使原料中的水分变为固态冰，然后在适当的真空环境下，将冰直接转化为蒸汽而除去，再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸汽冷凝，从而使物料得到干燥。因此干粉相比液体，外泌体中的细胞因子、生长因子、蛋白质、RNA、DNA等活性成分保存时间更久。发布于 2022-01-08 06:15赞同 42 条评论分享收藏喜欢
不断发展的外泌体：从无名小卒到后起之秀 | CAS
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不断发展的外泌体：从无名小卒到后起之秀
不断发展的外泌体：从无名小卒到后起之秀
Rumiana Tenchov
, Information Scientist, CAS
十二月 2, 2022
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外泌体被称为“天然的脂质纳米颗粒”，是正常生理状态或某些特定病理状态下从细胞中释放的细胞外囊泡子集。 因其具有在蛋白质、核酸和其他生物分子形式间传递信息的功能而广受科学界的关注。 外泌体在治疗和诊断方面的前景引起了来自企业和学术机构的兴趣。 为了预测并充分利用外泌体的潜力，重要的是要了解研究布局的深度和宽度。
在这个由三个部分组成的系列中，我们将先探索外泌体的历史，然后了解外泌体在药物递送和诊断方面的最新研究进展。 借助 CAS 内容合集™ 中的见解内容，我们提供了外泌体应用最新研究进展的布局视图，并强调在这一迅速扩大的领域所面临的机会与挑战。
外泌体应用的发展
50 多年前，研究人员首次在人体血浆中观察到微小颗粒。 他们发现这一物质 — 当时将其命名为“血小板微尘” — 富含脂质且可能参与血小板激活过程。 直到 20 世纪 80 年代才首次明确了这些大小在 30 至 150nm 之间的细胞外囊泡的定义，并创造了“外泌体”一词。
和脂质体一样，外泌体由脂膜和内部水介质组成。 但研究人员发现外泌体结构更复杂，含有大量蛋白质和脂质。 外泌体可在大多数真核细胞的内涵体间隔中产生，与质膜融合后释放至细胞外隙。 经分泌细胞释放后，通过几种机制向受体细胞传输信息，包括表面受体相互作用、质膜融合、受体介导的内吞作用、吞噬作用和/或微胞饮现象（图 1）。
图 1. 外泌体生物发生和分泌图示。 小图显示了外泌体的分子构成。
在明确初步表征后，进一步研究表明外泌体可由大多数活细胞类型分泌，包括免疫细胞、肠道上皮细胞和神经元。 外泌体同样也存在于多种生物体液中，如血液、尿液、唾液、乳汁、羊水、滑液、脑脊液甚至泪水。
细胞间运输的外泌体通路在许多健康功能和疾病中发挥着重要作用，包括免疫力、组织稳态和再生。 外泌体有助于保证细胞间通讯、细胞间和跨生物屏障（包括血脑屏障）间信号传递的高效进行。 外泌体是高效细胞传输系统，能运输具有生物活性的“载体”，例如蛋白质、脂质和核酸。 尽管外泌体参与重要的生理活动，但其在疾病发病机制中也发挥着关键作用，包括癌症、心血管和神经退行性疾病以及病毒感染。
外泌体颗粒的独特性质
为了解这些细小颗粒如何能诱发大规模效应，让我们从其独特性质入手。 首先，由于脂质二重膜结构，它们具有天然的稳定性，即使在严苛的肿瘤微环境中也可以传播。 双层脂膜也可以最大程度降低免疫原性和毒性，为其稳定进入细胞外隙提供支持。 外泌体因其内源性而表现出高度的生物相容性。 最后，外泌体具有优越的组织/细胞渗透能力。 凭借上述属性，外泌体具有克服与其他药物递送系统相关局限的潜力。 实际上，研究人员开始认识到外泌体相对于其他药物载体系统的优势。
CAS 对外泌体研究的见解
CAS 内容合集™ 是最大的人工收录的已发表科学文献合集，其中的一项分析揭示了外泌体出版物趋势的奇妙洞察。 目前，CAS 内容合集中有近 40,000 篇科学出版物（期刊文章和专利）与外泌体/细胞外囊泡有关，并随着时间的推移呈稳定指数式增长（图 2）。
图 2. 药物递送和诊断领域外泌体研究的期刊和专利出版物趋势及相关研究经费。 (A) 与药物递送和诊断领域外泌体相关的出版物数量趋势，包括期刊文章和专利。 (B) 与 NIH 年度资助相关的、来自美国组织的文件数量。
在过去的 3 至 4 年里，外泌体比脂质纳米颗粒 (LNP) 更适合作为潜在药物载体，与外泌体应用于药物递送相关的文件（包括专利和期刊文章）数量已经远远超过 LNP 的文件数量（图 3）。
图 3. 应用于药物递送的外泌体和脂质纳米颗粒出版物趋势。 (A) 与外泌体和脂质纳米颗粒相关的出版物数量趋势比较。 (B) 期刊文章 (JRN) 和专利 (PAT) 中外泌体 (EX) 和脂质纳米颗粒 (LNP) 相关出版物的相应百分比比较。
外泌体研究中的关键因素
根据 CAS 内容合集显示，美国、中国、韩国和日本在外泌体研究方面处于领先地位，与该领域相关的已发表期刊文章和专利数最多。 与外泌体相关的专利活动也在公司和学术机构间进行共享，凸显出对其在药物递送、诊断等领域前景的普遍认可。 在所有公司中，MD Healthcare、Codiak Biosciences 和 OncoTherapy Science 拥有的专利数最多，而加利福尼亚大学、路易斯维尔大学和浙江大学在大学和医院类别中处于领先地位（图 4）。 在专利分布方面，世界知识产权组织 (WIPO) 接收的专利申请数量最多，随后是美国专利局和中国专利局、欧洲专利局 (EPO) 及韩国专利局和日本专利局。
公司
专利数量
大学和医院
专利数量
MD Healthcare
51
加利福尼亚大学
43
Codiak Biosciences
44
路易斯维尔大学
28
OncoTherapy Science
33
浙江大学
26
Evelo Biosciences
26
中南大学湘雅医院
24
ExoCoBio
24
德克萨斯大学
23
Evox Therapeutics
18
康奈尔大学
20
Figene
12
国家纳米科学中心
17
Orthogen
11
西达赛奈医疗中心
16
Arbor Biotechnologies
10
东南大学
15
三星生命公益基金会
10
韩国加图立大学
15
Unicyte
9
韩国科学技术研究院
14
亨利福特医疗集团 (Henry Ford Health System)
8
中国人民解放军空军军医大学
14
Cavadis
7
叶迪特佩大学
14
Exosome Therapeutics
7
麻省理工学院
13
ExoStem Biotechnic
7
Mayo 医学教育研究基金会
12
Reneuron Limited
7
莫尔豪斯医学院
12
Biorchestra
6
俄亥俄州立大学创新基金会
12
Flagship Pioneering Innovations
6
麻省总医院
12
Isis Innovation Limited
6
暨南大学
11
NanoSomix
6
顺天乡大学
11
图 4. 与药物递送和诊断领域外泌体应用专利相关的公司 (A) 以及大学和医院 (B) 排名靠前的专利受让人。
外泌体的广阔前景
外泌体因其所具有的独特性质和在广泛生理与病理过程中所扮演的角色，已经成为药物递送和诊断领域的后起之秀。 这些天然纳米载体的潜在应用似乎并无限制，未来还将探索在化妆品和食物中的潜在应用。
在本系列的下一篇博客中，我们将借助 CAS 内容合集中的深刻见解深入探讨外泌体在药物递送和诊断中的主要治疗应用。 同时，您也可以在我们的外泌体洞察报告中阅读更多关于该主题的内容。
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概述
什么是外泌体？外泌体分离与富集外泌体鉴定与分析外泌体鉴定相关抗体外泌体功能研究肿瘤相关外泌体蛋白标志物
什么是外泌体？外泌体是细胞外脂质纳米囊泡，大小约为 30-150 nm，在大多数活细胞中通过胞吐作用主动分泌，存在于所有体液中，如血浆、尿液、血清、唾液和脑脊液 (CSF)等。外泌体含有脂质双分子膜结构，携带典型的跨膜蛋白和受体、粘附分子、脂筏相关蛋白、免疫调节分子。在外泌体腔内，可以发现多种蛋白质和核酸，根据不同的细胞类型而不同。作为细胞间通讯的关键信使，外泌体将生物活性分子传递给受体细胞，从而参与多种病理生理过程，包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。有一系列研究报道了肿瘤来源的外泌体在肿瘤进展、免疫调节和转移中的预后发挥重要功能。1 也有越来越多的证据表明，外泌体可用于早期癌症检测、预后和指导治疗。2外泌体分离与富集分离外泌体有许多种方法，每种方法都有自己的优点和局限性。但目前没有公认的分离方法，需要根据实验目标来选择3。外泌体分离的常用方法及比较外泌体分离与分析工具外泌体分离用免疫微球（无需预纯化）通过乳胶免疫微球与抗外泌体表面抗原的抗体共价偶联，捕获总外泌体群体或富集来自特定亚群的外泌体。所需样本体积小：血清(100-500μL), 血浆(0.5-1mL)操作简单，无需超速离心，无需预纯化捕获了外泌体的微球可直接进行核酸提取和蛋白的分析可通过洗脱缓冲液分离外泌体和微球洗脱的微球可重复利用一次产品名称货号样品类型说明1.0 micron Immunobeadsab288113血浆、血清、尿液用于外泌体分离外泌体捕获和定量试剂盒（无需预纯化）abcam提供总外泌体捕获和定量试剂盒，基于外泌体表面标志物与特异性抗体结合，通过专利的双夹心酶联免疫检测，可对来自少量人体生物体液或细胞培养基的外泌体进行定量和定性分析。样本体积小：100μL 生物样品（非纯化的外泌体）操作简单，无需超速离心，无需预纯化检测灵敏度高于Western Blot，最低可检测0.39μg 冻干外泌体适用于多标marker分析产品名称货号检测方法样品类型种属反应性说明Overall Exosome Capture and Quantification Assay Kitab287851比色法细胞培养上清Human用于细胞培养上清中外泌体的定量及定性分析。Overall Exosome Capture and Quantification Assay Kit (Human Serum, Colorimetric)ab287861比色法血清Human用于人血清中外泌体的定量及定性分析。Overall Exosome Capture and Quantification ELISA Assay Kitab285284比色法血浆Human用于人血浆中外泌体的定量及定性分析。ExoFACS试剂盒abcam ExoFACS试剂盒可以从细胞培养基中分离外泌体，并通过流式对外泌体进行表征分析。含阳性对照标准品无需外泌体预纯化适用于多标记Marker分析产品名称货号检测方法样品类型种属反应性ExoFACS Kitab287876流式细胞培养上清Human外泌体分离及流式分析试工具（需预富集）操作简便——采用免疫磁珠分离法，将样品与磁珠、检测抗体混合，使用磁座进行简单分离后，加入荧光检测抗体，即可通过流式细胞仪对捕获的外泌体进行分析。高度灵活——搭配不同的检测抗体即可进行外泌体免疫分型分析。适用一种或多种样本——细胞培养上清及血浆、尿液等⽣物体液样本均有相应产品适用。良好的线性关系——可搭配使用外泌体标准品绘制标准曲线，定量结果更准确。Beads产品名称货号样品类型检测方法CD326 Exosome Capture Beadsab239688细胞培养上清、血浆、 尿液流式CD9 Exosome Capture Beadsab239685细胞培养上清、血浆、 尿液流式CD63 Exosome Capture Beadsab239686细胞培养上清、血浆、 尿液流式D81 Exosome Capture Beadsab239687细胞培养上清、血浆、 尿液流式试剂盒产品名称货号检测方法样品类型种属反应性说明Exosome Isolation and Analysis Kit - Flow Cytometry, Cell culture (CD63 / CD9)ab267478流式细胞培养上清Human用于分离/检测CD63阳性的外泌体，Exosome Isolation and Analysis Kit- Flow Cytometry，Urine (CD63 / CD9)ab267480流式尿液Human用于分离/检测CD63阳性的外泌体Exosome Isolation and Analysis Kit- Flow Cytometry，Plasma (CD9 / CD81)ab267479流式血浆、血清Human用于分离/检测CD9阳性的外泌体。外泌体标准品实验对照及绘制标准曲线的最佳选择——abcam提供来自健康供体的人血浆、血清、尿液和唾液以及来自不同细胞系的高度纯化的冻干外泌体标准品，可作为实验对照或用于分析校准。品质优良且稳定——通过NTA、流式、电镜等应用验证，品质优良可靠。应用广泛——适用于不同技术进行蛋白标志物分析、外泌体核酸提取和分析、流式及电镜等分析。abcam也提供荧光标记的外泌体标准品，用于荧光显微镜下的外泌体跟踪。绿色染料可提供稳定的荧光标记，具有持久清晰的信号。外泌体标准品来源货号荧光标记说明Human Serumab286846Human Plasmaab288118Human Plasmaab288123是Human Urineab286884U-87 MG cell lineab286885cell line isolated from malignant gliomas from a patientMCF7 cell lineab239691human breast cancer cell linePC3 cell lineab239689human metastatic prostate cancer cell lineHT-29 cell line.ab239690 human colon cancer cell lineB16-F10 cell lineab288120是cell line isolated from skin tissue of a mouse with melanoma为什么选择abcam外泌体标准品？abcam外泌体标准品使用超速离心和微孔过滤的组合步骤进行纯化。虽然方法繁琐且耗时，但它能保证外泌体的高纯度。通过微孔过滤和差速离心循环可以大大降低其他微泡的污染。相反，使用化学试剂沉淀外泌体，同时也会沉淀较大的囊泡、蛋白质复合体、蛋白质-RNA复合体等，导致样品纯度较低。冻干的形式还方便标准品的长期储存。特点abcam 外泌体标准品某公司外泌体标准体每管的样品量100 μg50 μg分离方法超速离心和微孔过滤沉淀试剂Nanoparticles/mL（50ug人血清外泌体）3.75x10^10 p/mL2.29x10^9 p/mL最终形式Lyophilized（冻干）Frozen存储温度4°C （冻干形式）-20°C保质期3年1年
外泌体鉴定与分析外泌体分离和定量完成后，需要对外泌体进行鉴定。根据国际细胞外囊泡研究协会（ISEV）针对囊泡研究提出的MISEV2018 指南（定义细胞外囊泡及功能的最低实验要求）细胞外囊泡（EVs，含外泌体）鉴定主要分为总体表征和个体表征两部分4：总体表征蛋白鉴定建议用Western Blot或流式细胞术对阳性标志物和阴性标志物进行表征。要求至少包括1 个跨膜蛋白和1 个细胞溶质蛋白、1 个阴性蛋白质标志物。个体表征粒径分析：应用动态光散射(DLS)或纳米颗粒跟踪分析(NTA)方法，对粒径分布进行分析。形态表征：应用透射电子显微镜（TEM）或原子力显微镜（AFM）方法对EVs的形态及粒径进行表征。
外泌体鉴定相关抗体abcam提供高特异性、高灵敏度的外泌体标志物抗体。靶标货号克隆号应用种属反应性靶点说明备注组合(Calnexin，CD9，CD63，CD81，Hsp70，TSG101)ab275018---Calnexinab133615EPR3633(2)Flow Cyt (Intra), WB, IHC-PMs, Rat, Hu阴性标志物，ER Membrane Marker敲除验证CD9ab263019EPR23105-125IP, WB, IHC-P, Flow CytHu跨膜蛋白敲除验证ab286172A1501WB, ELISA, IHC-Fr, IPHuCD63ab134045EPR5702WB, IHC-PHu跨膜蛋白敲除验证CD81ab109201EPR4244WBMs, Rat, Hu跨膜蛋白ab286173A1504WB, ELISA, Flow CytHuHsp70ab181606EPR16892Flow Cyt (Intra), IHC-P, WB, ICC/IFMs, Rat, Hu分子伴侣蛋白TSG101ab125011EPR7130(B)Flow Cyt (Intra), IHC-P, WB, ICC/IFMs, Rat, HuESCRT复合体相关蛋白种属说明：Hu（Human）、Ms（Mouse）。敲除验证：该标记表示abcam 以基因敲除细胞系做为阴性对照，对该产品进行了敲除验证，以确认抗体对目标蛋白的特异性。
外泌体功能研究肿瘤相关外泌体蛋白标志物abcam 提供高质量的肿瘤相关外泌体蛋白标志物抗体，可用于胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、恶性胶质瘤、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、胆管癌等研究。点此下载《液体活检解决方案》，获取完整肿瘤相关外泌体蛋白标志物及抗体列表。参考文献1. Ayuko Hoshino, Han Sang Kim, etc.. Extracellular Vesicle and Pa rticle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. Cell. 2020 Aug 20; 182(4): 1044–1061.e18.2. Chen IH, Xue L, etc.. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017 114, 3175–3180.3. Shiyu Li, Ming Yi, etc.. The role of exosomes in liquid biopsy for cancer diagnosis and prognosis prediction. Int J Cancer. 2021 Jun 1; 148(11): 2640–2651.4. Clotilde Théry, Kenneth W Witwer, etc.. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750.5. Tao Huang and Chu-Xia Deng. Current Progresses of Exosomes as Cancer Diagnostic and Prognostic Biomarkers. Int J Biol Sci. 2019; 15(1): 1–11.6. Bradbury A and Pluckthun A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 518:27-29 (2015).7. BenchSci. [Accessed 15/06/2020] (2020)8. Zhong Z, Sassi M, Heaton S, Koch S, De Block G, Conlon D, Lochead J, Dreja H, Munro M, Solache A, Hamilton B. Large-scale use of knockout validation to confirm antibody specificity. J Immunol 200 (1 Supplement) 120.18 (2018).
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2022年JEV期刊亮点论文盘点 | 单个外泌体表征分析技术 - 知乎
2022年JEV期刊亮点论文盘点 | 单个外泌体表征分析技术 - 知乎首发于外泌体切换模式写文章登录/注册2022年JEV期刊亮点论文盘点 | 单个外泌体表征分析技术QuantumDesign Bioscience已认证账号外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，是细胞间信号传输的载体。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，参与细胞间通讯。近年来，外泌体的研究热度持续攀升，在2019年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目的总数突破500个，立项的总金额突破2亿元。但由于外泌体的尺寸（30~200 nm），常规的光学显微镜无法对其进行成像分析，因此很少有技术能够对单个外泌体进行物理表征和蛋白分型。美国NanoView Biosciences公司推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView系统，采用了SPIRS成像技术，只需要少量样品即可一次完成外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位、亚群分布的分析。全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，目前在全球已近100多个实验室采用该技术，发表文献超过150篇。进入2022年，使用ExoView发表的论文出现井喷性增长，短短数月已经发表了近50篇。本文选取了三篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）发表的比较有代表性的文章，来说明ExoView在血样本、光诱导、心功能不全等研究领域的具体应用。四跨膜蛋白区分人血清和血浆中不同外泌体亚群-血浆中血小板外泌体的贡献早期研究证明从血液中分离外泌体的能力对于将外泌体开发为疾病的生物标志物至关重要，尤其是从血浆和血清中分离外泌体，但很少有研究系统地比较这些来源的外泌体类型。Nasibeh Karimi等[1]对确定血浆和血清中不同外泌体亚群的存在进行了研究。研究人员采集健康受试者血液，分别用 K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血浆，同时用血清凝块激活剂管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和质谱等技术分析分离出的外泌体亚群。结果表明人类血液中含有多个携带不同四跨膜蛋白的外泌体亚群，使用不同的抗凝剂和离心方法，会影响外泌体亚群的分析。其中，研究人员使用ExoView对从血浆（EDTA）、血清以及人肥大细胞系分离的外泌体进行检测，结果显示在血浆和血清的样本中，血小板蛋白CD41a抗体捕获较多的是CD9+外泌体。与血清相比，血浆中的CD9+外泌体更多，并且是从血小板释放的（图1 a,b,c），然而血清中的CD63+/CD41a+外泌体的数量高于血浆（EDTA）（图1 m,n），这与之前的磁珠ELISA法的结果保持一致。另外，在血浆、血清样本中，被CD81抗体捕获的外泌体的CD63+比例较低，而CD9+比例较高（图1 a,b,d,e,g,h），进一步验证了早先的研究结果，但是在人类肥大细胞系的样本中，研究人员没有观察到这种差异（图1 c,f,i,l）。另一方面，粒径分析的结果显示CD41a和CD9抗体捕获的外泌体的粒径相对较小，表明捕获的外泌体是单外泌体，而不是外泌体聚合物（图1 o）。图1 ExoView检测从血浆、血清、人肥大细胞系分离的外泌体的数量、共定位和粒径光诱导免疫功能外泌体的高效产生基于外泌体的治疗方法和疫苗正在不断兴起，然而基于临床应用剂量规模的研发始终是一个巨大的瓶颈。为了克服这样的障碍，Shaobo Ruan[2]等开发了一种简单直接的方法，通过利用近紫外LED灯（365 nm）的光感应来促进树突状细胞分泌外泌体 (DEV)。体外和体内实验的结果显示，近紫外波长不会损害细胞生长，使DEV生产率提高了13倍以上，同时让DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成为理想的治疗平台。其中，研究人员使用ExoView对DEV的免疫性标记物进行检测，把样品组分为未处理的成熟树突状细胞来源的外泌体（mDEVs）、未处理的未成熟树突状细胞来源的外泌体（imDEVs）、近紫外光照射的成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-mDEVs）、近紫外光照射的未成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-imDEVs）。结果显示在所有的分组中，CD9抗体捕获的外泌体数量始终比CD81抗体捕获高4倍多，这表明大多数DEV具有CD9表达，但可能不具有CD81表达（图2 b,c,d)。CD63是外泌体中常见的结构和功能蛋白，这使得CD63+外泌体数量远高于MHC-I+、MHC-II+、CD86+。以CD63作为内部参考，研究人员进行了两次平行实验以评估MHC-I/MHC-II与CD86的表达水平(图2 c,d)。使用归一化方法计算总捕获DEV的生物标记物的相对百分比，结果表明mDEVs的MHC-I、MHC-II和CD86表达略高于imDEVs的表达（图2 g,h）。该结果与早先研究结果一致，即mDEVs具有更强的免疫反应诱导性。此外，CD63/MHC-I/CD86、CD63/MHC-II/CD86、MHC-I/CD86、MHC-II/CD86或CD63/CD86的共表达在不同的 DEV条件下以及有或没有进行光处理没有明显变化，尽管单独的MHC-I或MHC-II在光处理后表现出轻微的减少（图2 e,f），这证明光诱导对DEV的免疫标记表达几乎没有影响。在 DEV上保留必要的免疫标志物对于免疫反应至关重要。图2 ExoView检测mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性标记物的数量、共定位以及进行荧光成像含miR-421的外泌体与空气污染（PM2.5）诱导心功能不全的发生机制相关大气细颗粒物（PM2.5，空气动力学直径≤2.5μm）是空气污染的主要原因。越来越多的证据表明，大气PM2.5浓度的升高与总死亡率呈正相关，尤其是心血管疾病和呼吸系统疾病的死亡率。 PM2.5急性/亚急性暴露对人体的危害不容忽视，但是对于呼吸系统亚急性暴露于PM2.5所诱发心脏功能不全的分子机制尚不明确。上海大学王红云[3]等在大气污染相关的心血管疾病研究方面取得新进展，揭示了大气PM2.5亚急性暴露引发心功能不全的新的分子机制：大气PM2.5亚急性暴露在肺损伤后促进外泌体释放其携带的miR-421，通过抑制ACE2导致 PM2.5诱导的心功能不全。其中，研究人员使用ExoView对从暴露于PM2.5的细胞上清液提取的外泌体以及对照组进行检测。结果显示，与对照组相比，PM2.5组的外泌体数量显著比对照组多（图3 a）。另外，粒径的结果显示了两组外泌体的粒径大小接近（图3 d）。多色荧光成像图表明，与对照组相比，PM2.5暴露增加了 CD63/CD81/CD9 共定位外泌体的数量（图3 c）。这些数据证明了PM2.5 暴露可显着增加CD63+、CD81+和CD9 +外泌体。图3 ExoView检测从暴露于PM2.5的细胞上清液提取的外泌体和对照组外泌体的计数、粒径以及进行荧光成像在上述三篇文章中，科学家借助美国NanoView Biosciences公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测样本中的外泌体，无需纯化，操作简单。一次结果直接输出外泌体粒径，数目，蛋白表型，不同亚群的含量、多色荧光成像图。三篇文章分别从血样本、光诱导、心功能不全等研究领域介绍了ExoView的无需纯化，全面表征的特点，有力地证明ExoView是外泌体检测的一大利器。样机体验及合作发表文章为了更好的服务中国客户；Quantum Design中国子公司在北京建立了专业的客户服务中心，正式推出专业的全方位外泌体表征测试服务，您只需要很少量样品即可获得全方位的外泌体表征数据。服务推出至今，短短一年时间已经助力多个单位客户发表高水平文献：☛ 上海大学在《Journal of extracellular vesicles》发表文章。☛ 中国科学院深圳技术研究院在《Lab on a Chip》发表文章。☛ 北京天坛医院、国家纳米科学中心、北京航空航天大学在《Advanced Science》发表文章。☛ 同济大学附属上海市肺科医院、上海思路迪转化医学在《Journal of Nanobiotechnology》发表文章。☛ 山东千佛山医院在《NANO LETTERS》发表文章参考^Nasibeh Karimi, Razieh Dalirfardouei, Tomás Dias, Jan Lötvall, Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213. https://doi.org/10.1002/jev2.12213^Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12194. https://doi.org/10.1002/jev2.12194^Hongyun Wang, Tianhui Wang, Wei Rui, Jinxin Xie, Yuling Xie, Xiao Zhang, Longfei Guan, Guoping Li, Zhiyong Lei, Raymond M Schiffelers, Joost P G Sluijter, Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppresses air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signalling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222. https://doi.org/10.1002/jev2.12222编辑于 2022-09-07 10:16外泌体细胞生物学生物学赞同 2添加评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录
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外泌体治疗和诊断：通往临床巨头之路
外泌体治疗和诊断：通往临床巨头之路
Xinmei Wang
, Information Scientist, CAS
十二月 9, 2022
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外泌体是正常生理状态或某些特定病理状态下从细胞中释放的细胞外囊泡纳米级子集。 在我们之前关于外泌体进化的博客中，我们对这些天然纳米颗粒的进展（从初始探索到细胞外囊泡研究的最新进展）进行了探讨。
在这个由三篇博客组成的系列文章的第二部分中，我们将探讨 CAS 内容合集™ 的进一步见解，该合集是最大的人工收录的已发表科学文献合集，对外泌体治疗在药物递送和诊断中的关键应用进行了总结。
外泌体治疗的研究趋势
借助 CAS 内容合集，我们对与药物递送和诊断中外泌体应用相关的科学出版物中某些关键概念的存在和趋势进行了分析（图 1）。 关键词“靶向”和“生物标志物”排在首位，反映出人们对外泌体在治疗中作用的兴趣日益浓厚。 值得注意的是，对 2017 年至 2021 年关键概念的分析显示，在过去两年中，对“血脑屏障”一词的使用急剧增加，表明该词是外泌体治疗研究中的一个热门话题。 正如我们在第一部分中了解到的，外泌体可以穿过血脑屏障。 跨越这一高度选择性边界的能力不仅使外泌体成为有价值的诊断工具，还提供一种向大脑输送治疗物质的方法，有助于治疗癌症和创伤性脑损伤。
图 1. 与外泌体在药物递送和诊断中应用相关的科学出版物中的关键概念：(A) 探讨外泌体应用在治疗和诊断中关键概念的出版物数量。 (B) 2017 至 2021 期间，与外泌体治疗应用和诊断相关的文章中提出的关键概念的趋势。 每个重要概念每年的百分比由其当年的年度出版物数量除以当年的年度出版物总数计算得出。
外泌体治疗中至关重要的第一步：分离和纯化外泌体
在外泌体可用于大规模医疗实践之前，关键是要将这些纳米颗粒与广泛的细胞碎片和干扰成分准确区分开来。 外泌体分离和分析没有单一的标准化方法，每种方法都具有独特的优势和局限性（如表 1 所示）。 虽然超速离心法曾经被认为是金标准方法，但近年来沉淀和微流法被证明更受欢迎，因为它们能够在不造成潜在损害的情况下纯化外泌体（图 2）。 这些方法中的方法组合被认为是改善分离结果的一种乐观策略。 这是为了提供在大小、形态、浓度、外泌体富集标记物和污染物缺乏方面具有高纯度的外泌体子集。
表 1. 外泌体分离/纯化的主要方法
方法
优点
缺点
超滤
低成本
时效性
简单
外泌体的潜在损害
膜堵塞
超速离心法
适用于大体积样品
未引入其他标记
低成本
设备成本高
劳动密集型
外泌体的潜在损害
低产量
免疫亲和
适用于大体积样品
简单
可扩展性
外泌体完整性的潜在损害
昂贵的试剂
非特异性结合
聚合物沉淀
广泛应用性
简单快速
无外泌体变形
缺乏特异性和选择性
低纯度
聚合物污染
排阻色谱法
保持生物活性
无预处理
高产量
潜在污染
设备成本高
微流控
高效率
快速样本处理
高便携性
易于自动化和集成
大量原料
样本容量低
图 2. 2014 至 2021 年期间，与外泌体治疗应用和诊断涉及的各种外泌体分离方法的文献数量的趋势。 （每个分离方法每年的百分比由其当年的年度出版物数量除以当年使用同一隔离方法的年度出版物总数计算得出。）
外泌体治疗和药物递送
一旦外泌体被提取和纯化，我们如何将其转化为有效的药物递送系统？ 幸运的是，外泌体能够发挥这一作用，结合了合成纳米载体和细胞介导药物递送系统的优点，同时避免了它们的局限性。 利用这些特性的第一步是“货物装载”，即用治疗材料包装外泌体的过程。 为此，采用了几种货物装载方法，各有优缺点（表 2）。
表 2. 货物装载技术
方法
优点
缺点
细胞转染
适用于核酸和蛋白质
适用于大型货物
细胞毒性
难以净化
直接共孵育
简单便捷
温和
装载效率低
超声处理
装载效率高
生热
聚集
电穿孔
装载效率高
可控
聚集
冻融
适用于核酸和蛋白质
温和而简单
效率不确定
聚集
挤压
装载效率高
统一大小
外泌体膜可能受损
作为一种细胞间信使，外泌体在不同的生理过程中发挥着至关重要的作用。 因此，不同组织和细胞分泌的外泌体表现出独特的特性。 例如，已发现的肿瘤衍生外泌体会影响肿瘤特性，如生长、血管生成、侵袭和转移。 相比之下，来自间充质干细胞 (MSC) 的外泌体所具有的特性使其成为支持和补充其他治疗方式的理想佐剂。 事实上，美国公司 Direct Biologics 正在探索 MSC 衍生的治疗性 ExoFlo 在溃疡性结肠炎、实质器官排斥和新型冠状病毒感染 (COVID-19) 等临床试验中的用途。
虽然外泌体治疗的潜在应用范围很广，但目前外泌体研究最常见的领域是癌症，其次是炎症和感染。 通过分析外泌体供体细胞与其所应用的疾病之间的相关性，展现出一个明晰的模式。 抗原呈递细胞和自然杀伤细胞是癌症研究中最常用的细胞。 巨噬细胞和干细胞是炎症中最常用的，而抗原呈递细胞和 T 细胞则常见于感染（图 3）。
图 3. 外泌体供体细胞与外泌体治疗和诊断相关研究中应用外泌体的疾病之间的相关性，如 CAS 内容合集中的文件数量所示。
外泌体治疗的多种靶向应用
外泌体的另一个快速扩展和值得注意的应用是其作为治疗剂的用途。 外泌体系统已被用作治疗或诊断多种疾病的工具。 我们对 CAS 内容合集的分析表明，大多数关于外泌体疗法的出版物 (68%) 与癌症相关。 外泌体微小核糖核酸 (miRNA) 已被证明可以抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。 已经在各种恶性细胞亚型中使用该方法进行了探索，包括膀胱癌、结直肠癌和乳腺癌。 外泌体在神经退行性疾病、炎症和心血管疾病中也具有巨大的治疗潜力，这些疾病也具有一定的代表性（图 4）。
图 4. CAS 内容合集中与目标疾病外泌体治疗和诊断应用相关的出版物的分布情况。
由于外泌体参与诸如癌症等疾病的发病机制，成功的治疗策略可能包括将升高的外泌物生产和循环降低到正常水平，以防止疾病进展。 一些进行中的研究正在对不同步骤调节外泌体治疗途径的影响进行探索，包括其产生、释放和吸收。 还对癌症细胞中的外泌体物理消除进行了探索，研究人员假设这种消除会阻碍肿瘤细胞之间的沟通，从而导致肿瘤进展。
外泌体的诊断应用
为了使临床应用切实可行，生物标志物必须具有多种特性。 应易于获取、经济高效、具体、高度敏感且可衡量。 由于其独特的特性，外泌体已经满足了其中几个条件，与基于血清的传统生物标志物相比显示出优势，特别是在诊断灵敏度和准确性方面。
以这种治疗方式应用外泌体有几个优点。 首先，由于细胞的病理状态极大地影响外泌体的含量（如在阿尔茨海默病中所观察到的），研究这些细胞外囊泡可以为了解组织的疾病状态提供一个窗口。 它们也是天然稳定的，具有脂质双层，即使在恶劣的微环境中也能抵抗降解。 就实用性而言，外泌体可以便捷且无创地从尿液、血液甚至眼泪等生物液体中分离出来。 提取出后，可以通过冷冻、冷冻干燥或喷雾干燥来储存。 最后，与许多传统的血清生物标志物不同，外泌体可以通过血脑屏障，提供难以获取的脑细胞相关信息。 目前正在探索几种候选的外泌体蛋白生物标志物（表 3）和核酸生物标志物（表 4）。 有关这些生物标志物的扩展列表，请参阅我们的 ACS 出版物（外泌体：自然界的脂质纳米颗粒，药物递送和诊断领域的新星）。
表 3. 用于临床诊断应用的外泌体蛋白示例
蛋白质
疾病
体液
CD81
慢性丙型肝炎
血浆
CD63、小窝蛋白-1、TYRP2、VLA-4、HSP70、HSP90
黑素瘤
血浆
表皮生长因子受体 VIII
恶性胶质瘤
血浆
生存素
前列腺癌
血浆
c-src
浆细胞肿瘤
血浆
NY-ESO-1
肺癌
血浆
PKG1、RALGAPA2、NFX1、TJP2
乳腺癌
血浆
磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1
胰腺癌
血清
磷脂酰肌醇蛋白聚糖 1
结肠直肠癌
血浆
AMPN VNN1、PIGR
胆管癌
血清
CD24、EpCAM、CA-125
卵巢癌
血浆
CD91
肺癌
血清
Fetuin-A、ATF 3
急性肾损伤
尿液
CD26、CD81、S1c3A1、CD10
肝损伤
尿液
NKCC2
巴特综合征 1 型
尿液
EGF、Gs 亚基、抵抗素、视黄酸诱导蛋白 3
膀胱癌
尿液
A2M、HPA、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH
鳞状细胞癌
唾液
LMP1、半乳糖凝集素-9、BARF-1
鼻咽癌
血液、唾液
CALML5、KRT6A 和 S100P
干眼症
眼泪
表 4. 癌症治疗和诊断试剂外泌体 miRNA
miRNA
癌症类型
应用
miR-378
非小细胞肺癌
预后
miR-423、miR-424、let7-i 和 miR-660
乳腺癌
诊断
miR-423-3p
前列腺癌
预后；去势抵抗
miR-30a
口腔鳞状细胞癌
治疗；顺铂敏感性
miR-106b-3p
结肠直肠癌
治疗
与外泌体治疗和诊断应用相关的文献数量广泛增长，反映了对外显体作为生物标记物的兴趣，如 CAS 内容合集分析所示（图 5）。 虽然乍一看，与治疗相关的文档排在首位，但两项应用的文档比例大致相同。
图 5. 外泌体的诊断与治疗应用：(A) 外泌体治疗与诊断应用相关文献数量的比较；插图：与外泌体在治疗和诊断中的应用相关的文件数量的年度增长。 (B) 就其作用指示（THU，治疗性；DGN，诊断性）比较外泌体在治疗和诊断中的应用相关的文献数量。
虽然目前的外泌体治疗研究前景广阔，但许多研究仍处于临床前阶段。 也就是说，我们距离在治疗和诊断中充分利用外泌体有多远？ 阻碍我们前进的障碍和挑战是什么？ 在本系列的最后一篇文章中，我们将揭示外泌体研究中的关键参与者，并更新这一令人兴奋和充满活力的领域的关键研究计划的最新进展。 同时，您也可以在我们的外泌体洞察报告中阅读更多内容。
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科普 | 外泌体——EXosomes，究竟是何方神圣？|细胞|研究|方法|影响|肿瘤|-健康界
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科普 | 外泌体——EXosomes，究竟是何方神圣？
2020
05/15
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西安九州医学中心
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近年来“外泌体-EXOSOME”在再生医学和美妆领域屡屡被提起，那么它究竟是何方神圣呢？
外泌体（Exosomes）是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的直径在30nm到1000nm的圆形单层膜结构的细胞外小囊泡。外泌体的电镜照片其实，外泌体最初被认为是细胞的“垃圾”，最近的研究表明，所有被检测的体液均含有大量的外泌体，这些囊泡可以携带蛋白，运送RNA,在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体，来源：Beckman Coulter外泌体可能通过调控免疫功能，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。毫无疑问，外泌体的基础和应用研究领域的飞速发展将会极大地影响未来生物医药的前景……目前学术界主流观点认为外泌体的产生过程为：细胞膜内陷形成内体（ endosome ） ， 然 后 再 形 成 多 泡 体（multivesicular bodies，MVB），最后分泌到细胞外成为外泌体。研究表明，所有类型哺乳动物细胞在培养过程中都可以分泌产生外泌体。外泌体最早被认为是细胞排泄废物的一种方式。随着研究的不断加深，发现外泌体功能多样，其可参与到机体免疫应答、抗原递呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。近年来外泌体研究热度持续增长，从2011年后发表文章数量激增。外泌体的构成外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年， Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的 exosom e可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。外泌体的提纯方式一是超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法 。此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块， 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种 方法得到的是微泡不是外泌体 。二是过滤离心， 这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性 ，但同样存在纯度不足的问题。三是密度梯度离心法， 用此种方法分离到 的外泌体纯度 高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态 的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性， 不便进行下一步的实验 。五是PS亲和法，该方法将PS（磷脂酰丝氨酸）与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9 《Scientific Reports》 杂志发表了该方法最新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。六是色谱法，这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一， 但是需要特殊的设备 ， 应用不广泛 。外泌体的作用Exosome携带了包含细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白及特殊蛋白质；参与细胞活动的重要调控，有望成为多种疾病的早期诊断标志物；Exosome在作为基因和药物运载、肿瘤和肿瘤生物学研究方面已经成为热点。
本文由作者自行上传，并且作者对本文图文涉及知识产权负全部责任。如有侵权请及时联系（邮箱：guikequan@hmkx.cn）
关键词:
细胞,研究,方法,影响,肿瘤
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